選擇性必修3第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具課前預(yù)習(xí)課件ppt

這是一份選擇性必修3第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具課前預(yù)習(xí)課件ppt，共54頁。PPT課件主要包含了第三章基因工程，本節(jié)聚焦，牛刀小試，拓展延伸，DNA的粗提取與鑒定，探究和實(shí)踐等內(nèi)容，歡迎下載使用。
基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外____________和____________等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做__________技術(shù)。 例如，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素。在此實(shí)例中，目的基因是_______________，受體細(xì)胞是________________，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物是____________。
2021人教版（新教材）必修二 遺傳和進(jìn)化
第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具
重組DNA技術(shù)所需要的三種基本工具是什么？他們的作用是什么?基因工程載體需要具備什么條件？
DNA重組技術(shù)的基本工具是什么？
主要從原核生物中分離純化
根據(jù)你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。
一、限制性核酸內(nèi)切酶 ——分子手術(shù)刀
現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)核酸切酶(限制酶)。
練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens）
大腸桿菌（Escherichia cli R）
（1）識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列
大腸桿菌的EcRⅠ限制酶只能識別GAATTC序列，
（2）在特定的位點(diǎn)切割DNA分子。
特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開
大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成,少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成
1.已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。 （1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割； （2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
……GAATTC…………CTTAAG……
不同來源的DNA片段混合
如何將不同種來源的DNA片段連接起來？
……G　　AATTC…………CTTAA　　G……
1.DNA連接酶的作用是：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被________切開的兩個__________之間的____________。
二、DNA連接酶 ——分子縫合針
DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?
以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈
將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板
與DNA相關(guān)的五種酶的比較
關(guān)于下圖所示黏性末端的敘述，正確的是
A.①與③是由相同限制酶切割產(chǎn)生的B.DNA連接酶可催化①與③的連接C.經(jīng)酶切形成④需要脫去2分子水D.DNA連接酶與DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
通常是利用______作為載體，將目的基因送入受體細(xì)胞中。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有__________能力的很小的雙鏈_____DNA分子。 在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有____________、_____________________等。
DNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)
三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車
質(zhì)粒作為運(yùn)載體的條件： ①質(zhì)粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，便于_____________________； ②質(zhì)粒含有復(fù)制原點(diǎn)，可在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體細(xì)胞______________； ③質(zhì)粒DNA分子上有特殊的____________，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，供重組DNA的____________。
外源DNA片段（目的基因）插入
普通的細(xì)菌一般是對抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四環(huán)素的培養(yǎng)基中______（能/不能）生長。如果給普通細(xì)菌導(dǎo)入一個含有四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒，四環(huán)素抗性基因的____________可使細(xì)菌獲得抵抗四環(huán)素的性狀。
如何利用標(biāo)記基因的篩選呢？
圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。
（1）上述操作中不宜選用Sma I，原因是Sma I會破壞__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcR I，原因是用EcR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
選用一定的物理或化學(xué)方法，分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子
2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提?。?br/>利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。
DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同
利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀；
或者讓其他成分溶解，DNA析出
（二）DNA等大分子的理化性質(zhì)
①根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？
②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？
當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 ml／L時，DNA的溶解度最大，濃度為 0．14 ml／L時，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出
在NaCl溶液濃度低于0.14 ml/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14 ml/L時，DNA溶解度最?。划?dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。
2.DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性
① 蛋白酶——水解蛋白質(zhì)， 對DNA沒有影響
② 高 溫——大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才會變性
③ 洗滌劑——瓦解細(xì)胞膜， 但對DNA沒有影響
沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色
（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液
（三）除去濾液中的雜質(zhì)(純化)
（四）DNA的析出與鑒定
從下列材料中選取2～3種
菜花、香蕉、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜；魚卵、豬肝、雞血、哺乳動物的紅細(xì)胞；在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌
凡是含有DNA的生物材料都可以考慮,但是，選用DNA含量相對較高的組織，成功的可能性更大。
新鮮的雞血（注意要加入檸檬酸鈉，防止血液凝固）
不能。因?yàn)椴溉閯游锍墒斓募t細(xì)胞中無細(xì)胞核。
能否選用牛、羊、豬紅細(xì)胞血做實(shí)驗(yàn)材料？為什么？
動物細(xì)胞的破碎較易，以雞血為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水 ，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。
答：蒸餾水對于雞血細(xì)胞來說是一種低滲溶液，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。
討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？
討論1：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？
答：洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
②實(shí)例：提取洋蔥DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。
①植物細(xì)胞需要先用一定的洗滌劑溶解細(xì)胞膜
答：研磨不充分會使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。
討論2：如果研磨不充分，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？
1.攪拌的目的（注意應(yīng)沿一個方向快速攪拌，但也不能過快過猛，防止打碎DNA ）
加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA
2.這個步驟過濾獲得什么？
獲得含核物質(zhì)的濾液（獲取含DNA的濾液）（注意：此時釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，應(yīng)用3——4層紗布進(jìn)行過濾，除去一些顆粒較大的雜質(zhì)）
3.濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)（為了純化提取的DNA需要將濾液作進(jìn)一步處理）
（三）除去濾液中的雜質(zhì)
方案一、在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2ml/L，過濾除去不溶的雜質(zhì)，再加入蒸餾水，調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14ml/L，析出DNA，過濾除去溶液中的雜質(zhì)，再用2ml/L的NaCl溶液溶解DNA。
思考1：加入2ml/L的NaCl溶液，攪拌1min，注意應(yīng)沿一個方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
思考2：過濾溶解有DNA的2ml/L的NaCl溶液，獲得什么？
思考3：這一步過濾的目的是？
獲得含DNA的濾液，除去不溶的雜質(zhì)
思考4：加蒸餾水的目的是？
調(diào)節(jié)NaCl溶液物質(zhì)的量為接近0．14ml/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
思考5：這一步攪拌的目的是？（輕輕地沿一個方向不停地均與攪拌）
稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物
思考6：這一步過濾含DNA黏稠物的0．14ml/L的NaCl溶液，獲得什么？
獲得DNA黏稠物（ 紗布上的DNA黏稠物）
獲得DNA黏稠物。除去溶液中的雜質(zhì)
為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？
1.用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；2.用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。 因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。
討論：方案二與方案三的原理有什么不同？
方案二：利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白， 使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三：利用DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同， 使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離
思考：攪拌的目的(玻璃棒朝一個方向緩慢、均勻地攪拌)
卷起DNA絲狀物，獲取含雜質(zhì)較少的DNA
加入與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)95％)，靜置2－3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA
用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水
冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
⑴ 向兩支試管中分別加入 2ml/L NaCl 溶液5ml⑵ 其中一支試管中加入DNA絲狀物，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解⑶ 向兩支試管中各加入二苯胺試劑4ml⑷ 混勻后，置于沸水浴中加熱5min⑸ 待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化。觀察現(xiàn)象：
溶解絲狀物的溶液變?yōu)樗{(lán)色
原理：DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，后者與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)。
思考：可以單獨(dú)用甲基綠鑒定某種物質(zhì)是否是DNA嗎？
不可以，甲基綠同樣會和RNA結(jié)合呈綠色！
1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟的操作。加入酒精和玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。3.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。
稱取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml濃硫酸，用棕色瓶保存。臨用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙醛溶液。
觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新制備
（一）是否提取出了DNA
（二）分析DNA中的雜質(zhì)
本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。
⑴過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液 獲得含核物質(zhì)的濾液 ⑵過濾含粘稠物的0.14ml/LNaCl溶液 獲取紗布上的DNA粘稠物 ⑶過濾溶解有DNA的2ml/LNaCl溶液 得到含DNA的濾液
1.本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾 ,獲得什么？
第一次攪拌加蒸餾水的雞血細(xì)胞液 加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA第二次攪拌加2ml/L NaCl溶液的濾液 目的是使DNA充分溶解在2ml/ LNaCl溶液中第三次攪拌加蒸餾水至0.14ml/L NaCl溶液 稀釋NaCl溶液,析出DNA黏稠物第四次攪拌放入2ml/L NaCl溶液中紗布上的粘稠物 使DNA黏稠物充分溶解在2ml/L NaCl溶液中第五次攪拌體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精
2.實(shí)驗(yàn)中有五次用玻璃棒攪拌?分別有什么作用?
3.本實(shí)驗(yàn)兩次用蒸餾水
第一次：加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA
4.本實(shí)驗(yàn)兩次析出DNA
第一次：用0.14 ml／L 的NaCI溶液析出DNA，過濾除去溶液中的雜質(zhì)
第二次：用冷卻的95％的酒精，獲得含雜質(zhì)較少的DNA（利用DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精）
第二次：調(diào)節(jié)NaCl溶液物質(zhì)的量為0．14ml/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵及注意事項(xiàng)
1.破碎細(xì)胞，釋放DNA的過程中，若是血細(xì)胞，加水后必須充分?jǐn)嚢瑁粦?yīng)少于5min；若是菜花，則應(yīng)與研磨液混合，研磨時間不少于10min
2.用冷酒精濃縮和沉淀DNA時，所用的95%的酒精必須經(jīng)過預(yù)冷后才能使用
3.在用玻璃棒攪拌時，玻璃棒不能直接插燒杯底部，并且攪拌要輕緩，以便獲得較完整的DNA分子
4.由于玻璃表面帶電荷，DNA中的磷酸基業(yè)帶電荷而被吸附于玻璃表面，故實(shí)驗(yàn)中用塑料杯和試管可減少損失
1.材料中核物質(zhì)沒有充分釋放出來，如研磨不充分或蒸餾水的量不夠
實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯的原因分析
2.加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞
3.二苯胺配制時間過長，變成淺藍(lán)色，影響鑒定效果
4.析出含DNA的黏稠物時，蒸餾水一次快速加入，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5.實(shí)驗(yàn)中有多次攪拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作時不注意區(qū)分，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（注意：攪拌都沿一個方向進(jìn)行）